تصفيه (ديافيلتريشن): روشي موثر و سريع براي نمك زدايي يا تغيير باقر نمونه هاي بيولوژيكي

ديافيلتريشن روشي است كه غشاهاي فراپلايش (پالايش از لا به لاي صافي اي كه قادر به گذراندن ذرات بسيار و ريز ميكروسكوپي باشد) را براي تغيير، جابجايي يا كم كردن غلظت نمك يا مواد حل شده در محلول كه شامل پروتئين ها، پپتيدها، نوكلئيك اسيد و مولكولهاي ديگر مي باشد، مورد اشتباه قرار مي دهد. كه در اين حال با انتخاب صافي‌هاي غشاء نفوذپذير (تراوا) را براي جداسازي اجزا محلول بسته به اندازه مولكول به كار مي برد. يك غشا فراپالايش مولكول هايي را كه بزرگتر از منافذ غشا هستند را در خود نگه مي دارد. در حالي كه مولكولهاي كوچكتر مثل نمك و مواد محلول در آب كه قابليت نفوذپذيري %100 دارند، به راحتي از غشا عبور مي دهد. در اينجا ما مفاهيم مربوط به غلظت پروتئيني و ديافيلتريشن را شرح داده و روش هاي مختلف اجراي ديافيلتريشن و تاثير آنها روي مراحل زمان، حجم، ثبات و بازيافت را مقايسه مي كنيم.ب

غلظت:

   مواد محلول از طريق غشايي كه به عنوان تغليظ يا ابقا (حفظ كردن) شناخته شده در محلول حفظ مي شود. مواد محلول از درون غشايي مي گذرند كه صافي يا تراوش ناميده مي شود. يك غشاء، براساس خصوصيت دفعش براي نمونه  اي كه غليظ مي شود، انتخاب مي شود. طبق يك قاعده كلي، وزن مولكول براي غشاء (MWCO) بايد rd3/1 تا th6/1 وزن طبق، مولكولي باشد كه از غشا عبور نمي كند. اين يك ابقا كامل است. هر چند MWCO به آن نمونه (محلول) نزديك تر باشد، تشكيل ضايعات كوچك هم در طول مراحل غلظت بيشتر مي شود. ميزان جريان غشا (ميزان جريان صافي در هر واحد غشا) به اندازه منفذ ارتباط دارد. هر چه اندازه منفذ ها كوچكتر باشد، ميزان سرعت جريان غشاء براي همان فشار به كار رفته، كمتر مي شود. بنابراين وقتي غشايي براي غلظت/ تصفيه انتخاب مي شود بايد به عامل زمان در مقابل بازيافت توجه داشت. در بسياري از كاربردهاي بيولوژيكي، عامل بازيابي مهمتر از عامل زمان است. مرحله زمان هميشه مي تواند با افزياش ميزان سطح غشا به كار برده، كاهش يابد. شكل 1 نمونه يك محلول غليظ را نشان مي دهد.

شكل 1

در اين نمونه غشا تصفيه‌اي مناسبي قرار داده شده كه مولكول هاي بزرگ را در خودنگه مي دارد. فشار تا زماني وارد مي شود كه نصف حجم محلول از غشا عبور كند. مولكولهاي بزرگ در نصف حجم اصلي (محلول غليظ) باقي مي مانند كه در اين بخش نصف مولكول هاي نمك هم قرار دارند. تصفيه، نصف ديگر مولكول هاي نمك را در بر مي گيرد و شامل هيچكدام از مولكولهاي بزرگ نمي شود. بنابراين،  مولكول هاي بزرگ به عنوان مايع غليظ مي شوند و نمك خارج مي شود. مولكول هاي نمك به تناسب حجم در غلظت، ثابت مي ماند پس قدرت يوني محلول غليظ شده نسبتاً ثابت باقي مي ماند. قدرت يوني محلول غليظ مي تواند با «شستن» نمك باقيمانده كاهش يابد. اين مرحله تصفيه ناميده مي شود. مرحله رقيق سازي هم بسيار مهم است كه بعد از مرحله غلظت، انجام مي شود. در حالي كه صافي خارج مي شود، آب هم اضافه مي شود اگر محلول شستشو، به جاي آب، بافر ديگري باشد، نمك بافر جديد در نمك اوليه موجود در نمونه، جابجا خواهد شد.

تصفيه ناپيوسته- رقيق سازي مداوم (پي در پي):

در اين روش ابتدا نمونه را با آب بافر ديگر، به حجم از پيش تعيين شده، رقيق مي كنند. سپس نمونه رقيق شده با فراپالايش،  غليظ شده و به حجم اصلي اش بر مي گردد. اين مرحله آن قدر تكرار مي شود تا زماني كه نمك، مواد حلال در محلول يا مولكول هاي كوچكتر خارج شوند. با هر مرحله رقيق سازي مداوم، مولكول هاي كوچك بيشتري خارج مي شوند. همان طور كه در شكل 2 نشان داده شده اين نمونه معمولا با يك حجم مشخصي از بافر رقيق مي شود (1DV). در صورتي كه مخزن به اندازه كل حجم جا داشته باشد متناوباً چندين عامل ممكن است ميزان جريان صافي را افزايش دهد.

شكل 2

تصفيه ناپيوسته- كاهش حجم:

در اين روش ابتدا نمونه با يك حجم از پيسش تعيين شده غليظ مي شود و سپس محلول رقيق شده با آب يا بافر ديگري به حجم اصلي اش بر مي گردد. اين عمل آنقدر تكرار مي شود تا نمك، مواد حلال در محلول و مولكول هاي ريز خارج شوند. با هر مرحله غليظ سازي و رقيق سازي مولكول هاي ريز بيشتري خارج مي شوند. (شكل 3)

شكل 3

بعد از اينكه آخرين محلول بافر براي تكميل مرحله رقيق سازي اضافه شد، نمونه ممكن است قبل از تجزيه يا مرحله بعدي تصفيه غليظ شود. آخرين محلول به دست آمده بعد از تصفيه با هر روشي (كاهش حجم ناپيوسته x2 يا رقيق سازي مداوم) به اندازه همان حجم و غلظت شروع رقيق سازي است. غلظت نمك به طور مساوي در هر دو نمونه كاهش مي يابد. هرچند حجم تصفيه بافر كه با روش كاهش حجم به كار مي رود نصف آن حجمي است كه در رقيق سازي مداوم به كار مي رود. اين به خاطر، غلظت اوليه‌اي است كه حجم را تا نصف كاهش مي دهد. حجم تصفيه برابر با حجمي است كه رقيق سازي انجام مي گيرد بنابراين، نصف حجم نياز مي باشد. با اين مورد به نظر مي رسد كه غليظ سازي قبل از رقيق سازي با هر دو روش (تصفيه ناپيوسته يا تصفيه با حجم ثابت) بايد حجم تصفيه بافر مورد نياز را كاهش داده و زمان را هم حفظ كند. (هدر ندهد در بيشتر موارد اين حالت اتفاق مي افتد. عاملي كه ما آن را محاسبه نكرديم، سرعت جريان صافي است، كه برابر با مرحله زمان است. همان طور كه محلول توليد شده غليظ ميشود چسبندگي افزايش يافته و سرعت جريان صافي هم كاهش مي يابد. سرعت جريان صافي عكس سرعت غلظت است.

كه در اينجا

 = ميزان سرعت جريان صافي

= مقدار ثابت

 = غلظت لايه ژله اي

 = غلظت بقاء (جريان حجم)